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產(chǎn)品分類(lèi)

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色標(biāo)傳感器

高效感受態(tài)細(xì)胞制作

發(fā)布日期:2022-04-26 點(diǎn)擊率:65

方法一
A液:1M,MnCl2: 
B液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用無(wú)菌水配,配后不需滅菌; 
C液 稱(chēng)取CaCl2 0.10g,KCl 1.18g,全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶,然后加入46ml三蒸水,輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎,然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。 
取1管B液(0.6ml),全部加入C液(46ml)中,混勻后,再用1ml移液器加入3.3ml A液,混勻冰浴即可使用。 
    劃線得到單菌落,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時(shí), 挑取2-4個(gè)形態(tài)飽滿(mǎn)的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養(yǎng)基的三角瓶,37℃劇烈振蕩(300 rpms)培養(yǎng)3-4小時(shí), 將培養(yǎng)溫度調(diào)至18℃劇烈振蕩(3280 rpms)培養(yǎng),其余與普通感受態(tài)差不多,每管加入4ml TB緩沖液,輕輕振蕩,使菌體重新懸浮,加入280ml DMSO(可用國(guó)產(chǎn)分析純),混勻后分裝入1.5ml EP管,冰上靜置15分鐘。用紗布將所有裝有感受態(tài)的EP管包好,用棉線系好后放入液氮中速凍,在液氮中靜置12小時(shí)以上。取出感受態(tài)放入-70℃超低溫冰箱備用。 
效率非常高,一般可到10*8,好時(shí)可到10*9,特別適宜于大片段與文庫(kù)構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化。 

    潔凈是最重要的。無(wú)菌都無(wú)所謂,在操作臺(tái)上可正常操作。離心力要注意不要超過(guò)2500g,建議1500-2000g 5min。涂板要注意,不要覺(jué)得不勻而多次反復(fù),輕輕在平板上帶一下感覺(jué)板上大部分地方走過(guò)即可,特別在冰箱中保存過(guò)或在溫箱中溫浴2小時(shí)以上的板。涂完后建議空氣晾干(20-30分鐘)這樣會(huì)減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。 

    預(yù)冷是必要的。整個(gè)過(guò)程的低溫也并非特別重要,只要注意就行了,我在去殘液時(shí)經(jīng)常在室溫倒置1min,對(duì)感受態(tài)效率提高有幫助,第一次多加一點(diǎn)緩沖液,我經(jīng)常加至20ml,效果不錯(cuò)。

    關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多,最復(fù)雜的莫過(guò)于電轉(zhuǎn)化,而最簡(jiǎn)單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開(kāi)始轉(zhuǎn)化。對(duì)于做克隆工作的人而言,高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。 
    現(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率最高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化,可達(dá)到1010,但是操作起來(lái)比較麻煩。要想又簡(jiǎn)單,又能有較高的轉(zhuǎn)化效率,莫過(guò)于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法。 
    根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況,我們將其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有許多可改進(jìn)或需要注意的地方,其中有一些對(duì)普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。 
1、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要,是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的,毋庸置疑。 
2、培養(yǎng)基的裝量:培養(yǎng)基的裝量是很重要的,這關(guān)系到菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的能量代謝問(wèn)題,是有氧還是無(wú)氧生長(zhǎng)。厭氧生長(zhǎng)出來(lái)的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為:培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。 
3、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值,而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來(lái)說(shuō),接種前的pH值在6.8-7.2,等菌搖好后,可以測(cè)一下pH值,不要低于6.0,這表示菌體的代謝為有氧代謝,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,按要求做,肯定效率不低。 
4、培養(yǎng)后的OD值。其實(shí)這并一個(gè)非常重要的參數(shù),只是當(dāng)OD值大到一定的程度后,菌體要保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)已經(jīng)不太可能,因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6,0.8等等。同時(shí),OD值大時(shí)菌體總量大,因而感受態(tài)絕對(duì)數(shù)量要大一點(diǎn),因而需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn)。 
5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗(yàn)證明,當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時(shí),該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí),使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物,在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入,會(huì)收到很好的效果。 
6、培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)告訴我們,較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成,這樣可以獲得較高的感受態(tài),但太低又不實(shí)用,因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法,它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。 
7、此外文獻(xiàn)報(bào)道,在保存感受態(tài)時(shí),DMSO要比甘油的效果要好,它會(huì)使感受態(tài)的效率增加。 
8、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高,因此推薦用液氮速凍感受態(tài),然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時(shí)以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱,這點(diǎn)未做實(shí)驗(yàn),只是一種感覺(jué),第一次這樣做了,沒(méi)問(wèn)題,以后就照此辦理而已。

方法二
1.液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上劃線,37度過(guò)夜至長(zhǎng)出單菌落.
2.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個(gè), 接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基. 培養(yǎng)基量不可再多,會(huì)影響效率.
3.在18度 150-250RPM 培養(yǎng)19-50小時(shí)*沒(méi)有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高于37度.
4.OD600約0.4-0.8時(shí)停止培養(yǎng), 放在冰水中冷卻10分鐘
5. 4度, 300RPM離心15分鐘, 回收菌體
6.去掉上清后, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 在冷10分鐘
7.再次離心回收菌體
8.用1/12.5體積的TB懸浮, 添加最終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘
9.0.1-1毫升分裝, 直接在液氮中凍上.
10.在液氮或-80度保存.

【zihudie】
(1)將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上,37℃培養(yǎng)活化。
(2)挑取經(jīng)活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基,18℃,200-250rpm培養(yǎng)。
(3)當(dāng)OD600=0.5-0.8時(shí),用預(yù)冷的40mL離心管于4℃,8000rpm離心10min,收集菌體。
(4)用預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體,4℃,8000rpm離心10min,收集菌體。
(5)重復(fù)第4步操作。
(6)用8mL預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體,緩慢加入DMSO至終濃度7% 。
(7)冰浴10min后,分裝保存于液氮中。
本法效率極高,建議大家采納
【yog】
1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM過(guò)夜------1%轉(zhuǎn)接-------37度 200RPM2小時(shí)(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 棄上清, 懸浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重懸浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建議用TSS法,簡(jiǎn)單方便,比氯化鈣法的轉(zhuǎn)化效率高.別的菌可能不一定適用。
 

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